PHÁT HIỆN CÁC ĐIỂM ĐỘT BIẾN TRÊN GEN GYRA VÀ PARC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƯƠNG

Những nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết. Nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả: các chủng nhạy cảm có nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentratation – MIC) 0,002-0,060 g/ml không có đột biến gen. Các chủng có MIC càng cao càng xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Trên gen gyrA: 100% số chủng có đột biến tại codon 91 (Ser thành Phe). 63,8% số chủng có đột biến tại codon 95 (Asp thành Ala), các đột biến ở vị trí khác có tần số thấp hơn. Trên gen parC: 44,9% số chủng có đột biến tại codon 87 (Ser thành Asn). Đột biến ở codon 86 và 91  xuất hiện với tần số thấp hơn.
I. Đặt vấn đề

          Ciprofloxacin là một kháng sinh được chỉ định điều trị bệnh Lậu với liều uống duy nhất (500 mg), vì vậy kháng sinh này được thầy thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Do đó, việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc độ đề kháng đang tăng nhanh và nếu không có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới như Trees D. L và cộng sự (1998) tại Trung tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1], Su X. và Lind I. (2001) tại Đan Mạch [2]… về những chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin cho thấy: những chủng đề kháng với ciprofloxacin đều có những thay đổi trên gen gyrA và gen parC. Đó là các gen có liên quan đến kháng ciprofloxacin. Gen gyrA có độ dài 2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid; vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid. Gen parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hoá 768 amino acid; vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá 85 amino acid. Những nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu cho công tác phòng chống các bệnh lây truyền qua đường tình dục nói chung và bệnh Lậu nói riêng. Xuất phát từ những lý do trên đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu: góp phần tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.
II. Đối tượng và phương pháp
2.1. Đối tượng: trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến 2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, phân lập được 503 chủng. Nghiên cứu này đã chọn ngẫu nhiên 6 tháng từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm 2007 được 71 chủng vi khuẩn lậu.
2.2. Vật liệu

          Tủ nuôi cấy CO₂ Sanyo (Nhật Bản). Môi trường Thayer-Martin, Neisseria 4H, Oxidase(Mỹ). Thanh giấy E-test (Thụy Điển). Chủng chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp).

Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR và giải mã trình tự gen [3]

2.3.1. Kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu

Nhuộm Gram→Nuôi cấy trên môi trường Thayer-Martin→Test Oxidase và Neisseria 4H→Kết luận: Neisseria gonorrhoear→Tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E-test để xác định MIC của vi khuẩn lậu
2.3.2. Quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC

Sử dụng hóa chất của hãng Bio-rad (Hoa Kỳ) với 2 cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy trình PCR đối với gen gyrA và gen parC. Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 10x (5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl₂ 50 mM (1,5 ml); Taq polymerase 5 UI/ml (0,5 ml); Dung dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml). Tổng thể tích là 50 ml.
– Chu kỳ nhiệt:

93^oC 3 phút – [93^oC 30 giây – 52^oC 1 phút – 72^oC 1 phút]x30 chu kì – 72^oC 5 phút
– Sản phẩm khuếch đại gen

          Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch sau khi chạy điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromid 0,5 mg/ml trong 30 phút, rửa qua nước cất. Chụp ảnh bản gel trong buồng tối dưới ánh sáng cực tím. Sản phẩm PCR được dùng để giải trình tự.
2.4.2. Quy trình giải trình tự gen

          Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể chứa đột biến được thực hiện theo quy trình hướng dẫn của hãng.
a) Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute PCR Purification Kit:

Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. Cho toàn bộ dịch vào cột chiết tách.Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch lọc. Thêm 750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Hút bỏ dịch lọc. Ly tâm thêm 20.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 20 ml buffer EB vào chính giữa cột chiết tách. Để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút. Bảo quản ở -20^oC.
b) Phản ứng giải trình tự (Sequencing Reaction)

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen gyrA và gen parC.

ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Core Kit: Pha Premix gồm 5X sequencing buffer (4 ml); dNTP mix (1 ml); A dye terminator (0,5 ml); C dye terminator (0,5 ml); G dye terminator (0,5 ml); T dye terminator (0,5 ml); AmpliTaq (1 ml).
Thành phần phản ứng: Premix 8ml; sản phẩm PCR sau tinh sạch 5ml; mồi 3,2 pmol; nước cất vừa đủ 20ml.
Chu kỳ nhiệt:

96^oC 10 giây – [96^oC 10 giây – 50^oC 5 giây – 60^oC 4 phút]x25 chu kỳ – 4^oC 1 phút
c) Tinh sạch sản phẩm

          Thêm vào 20 ml sản phẩm sequencing: 3 ml KCH₃COO 3M pH=7,0; 14,5 ml nước cất; 62,5 ml cồn 100%. Để nhiệt độ phòng 15 phút. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ dịch nổi. Thêm 200 ml cồn 70%. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi. Để khô khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Hoà tan bằng 25 ml final buffer.

          – Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310 của hãng Applied Biosystem.

Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên cứu được so sánh với trình tự nucleotide của gen gyrA và parC của chủng vi khuẩn lậu gốc để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc.

3.2. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)

3.3. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)

          Nghiên cứu giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu gồm: 2 chủng nhạy cảm và 69 chủng đề kháng. Phân tích các đột biến trên gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột biến trên 2 gen này cho thấy: tất cả những chủng đề kháng đều có đột biến trên 2 gen gyrA và parC, số lượng đột biến cũng tăng theo nồng độ MIC. 2 chủng nhạy cảm MIC 0,002-0,060 g/ml (2,8%) không có thay đổi nào trong trình tự DNA. 11 chủng đề kháng có MIC 1-2 g/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến trên gen gyrA và không mang đột biến trên gen parC. 6 chủng đề kháng có MIC 1-2 g/ml (8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA và parC; 52 chủng đề kháng có MIC 3-32 g/ml (73,2%) mang 3 đột biến gồm 2 đột biến ở codon 91 (Ser thành Phe) và codon 95 (Asp thành Ala) của gen gyrA, và 1 đột biến ở codon 87 (Ser thành Asn) của gen parC. Như vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng đột biến [4]. Với MIC nhỏ, mang ít đột biến. MIC lớn mang nhiều đột biến hơn. Kết quả này tương đồng với những nghiên cứu của các tác giả trên thế giới [5], [6], [7]. Tuy nhiên nghiên cứu này thu được kết quả khác với các tác giả các tác giả trên thế giới là những chủng kháng ciprofloxacin đều có đột biến trên gen gyrA tại codon 91 (Ser thành Phe). Điều này có thể những chủng vi khuẩn lậu lây truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ cùng một chủng và mang tính khu vực [8]. Kết quả của nghiên cứu thu được đã chứng minh rằng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với ciprofloxacin, thuốc mà được xem như liệu pháp hàng đầu vào những năm 1990, đã tăng lên nhanh chóng ở mức MIC cao đáng báo động với các đột biến mới ở vi khuẩn lậu. Do đó sự giám sát liên tục về tính kháng kháng sinh, với khuynh hướng ngày càng gia tăng những chủng đa đề kháng lan truyền trong cộng đồng là rất cần thiết để có thể tránh những thất bại trong điều trị.
V. Kết luận

     Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon. Đích tác động của nhóm kháng sinh này là ADN gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn. Sự đột biến của vi khuẩn lậu (tại gen gyrA và parC làm thay đổi đích kháng sinh, do đó dẫn đến sự đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.
Tài liệu tham khảo

          1. Trees D. L., Sandul A. L., Whittington W. L., et al (1998). Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacin-resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother, 42(8):  2103-5.

          2. Su X., Lind I. (2001). Molecular basis of high-level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Denmark from 1995 to 1998″. Antimicrob Agents Chemother, 45(1): 117-23.

           3. Otero, L., et al. (2001). First Isolate of a Neisseria gonorrhoeae Strain   Associated With an Ofloxacin Treatment Failure in Spain. Sex Transm Dis, 28(10): 576-78.

          4. Xu J. S., Wang B., Wang C. X., et al (2006). Study on fluoroquinolone   resistance and the relationship between resistance and mutations of gyrA and parC in Neisseria gonorrhoeae. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi, 27(8):  702-4.

          5. Shultz T. R., Tapsall J. W., White P. A. (2001). Correlation of in vitro susceptibilities to newer quinolones of naturally occurring quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains with changes in gyrA and parC. Antimicrob Agents Chemother, 45(3), 734-8.

          6. Tanaka M., Nakayama H., Haraoka M., et al. (2000). Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high prevalence of ciprofloxacin-resistant solates in Japan, 1993 to 1998″. J Clin Microbiol, 38(2):  521-5.

          7. Zhang T., Zhou X., Chen Y., et al. (2009). Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in gyrA and parC genes in Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai, China. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 29(1): p. 29-34.

     8. Chaudhry U., Ray K., Bala M., et al (2002). Mutation patterns in gyrA and parC genes of ciprofloxacin resistant isolates of Neisseria gonorrhoeae from India“. Sex Transm Infect, 78(6): 440-4.