Chia sẻ cùng đồng nghiệpChuyên môn

Tính đa dạng của kháng thể dịch thể – Nội dung của một giải Nobel Y học và Sinh lý học

1. ĐẠI CƯƠNG

Cơ thể con người được bảo vệ bằng hàng rào miễn dịch tự nhiên (hay miễn dịch không đặc hiệu) và miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu). Miễn dịch không đặc hiệu là khả năng tự bảo vệ có sẵn trong cơ thể ngay khi được sinh ra, mang tính di truyền và không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước của cơ thể với kháng nguyên lạ xâm nhập. Miễn dịch đặc hiệu có các đặc điểm ngược lại và bao gồm 2 phương thức: miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào.

Miễn dịch dịch thể có vai trò bảo vệ chủ yếu trong các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm độc tố, một số bệnh nhiễm virus, ký sinh trùng…

Kháng thể dịch thể là các protein được sản xuất bởi tế bào lympho B, mỗi loại tế bào lympho B chỉ sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu cho một loại kháng nguyên. Cơ thể con người có khoảng 20000 gen, tức là trên lý thuyết chỉ sản xuất được tối đa 20000 loại tế bào lympho B và 20000 kháng thể; tuy nhiên trong suốt cuộc đời con người tiếp xúc với hàng tỷ kháng nguyên và vẫn có khả năng bảo vệ trước những kháng nguyên mới lạ này. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng, con người thực sự có thể sản xuất được hàng tỷ loại kháng thể khác nhau.

Vậy cơ chế nào giúp con người tạo ra một số lượng cực lớn các loại kháng thể như vậy? Hay nói cách khác, nhờ đâu mà con người có thể tạo ra sự đa dạng của kháng thể dịch thể?

Người tìm được câu trả lời cho câu hỏi này là nhà khoa học Nhật Bản Susumu Tonegawa. Năm 1976, ông phát hiện ra rằng, nhờ sự tái tổ hợp di truyền mà kháng thể có sự đa dạng rất lớn. Sau đó, ông được trao tặng Giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm 1987.

Bài viết dưới đây sẽ bàn luận rõ hơn về vấn đề này.

2. NHẮC LẠI CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CỦA KHÁNG THỂ DỊCH THỂ

2.1. Cấu trúc kháng thể

Kháng thể là một cấu trúc polypeptid với hoạt tính sinh học riêng biệt đối mỗi đầu của mỗi loại phân tử. Kháng thể được cấu tạo từ 4 tiểu đơn vị polypeptid với hai chuỗi nặng (H – heavy) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L – light) giống hệt nhau (Hình 1). Cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đều có các vùng (domain) hằng định (constant) và vùng thay đổi (variable) và tương tác với nhau thông qua các cầu nối disulua nội chuỗi và liên chuỗi. Vùng biến đổi, được gọi là F(ab’)2 (viết tắt của “fragment, antibody binding” tức là phần gắn của kháng thể), cho phép nhận biết kháng nguyên. Vùng hằng định, được gọi là Fc (viết tắt của “fragment, crystalline”), tương tác với các thụ thể trên bề mặt tế bào. Chuỗi nặng chứa vùng bản lề tạo ra tính linh hoạt để cho phép liên kết tối ưu với kháng nguyên.

Hình 1. Cấu trúc của kháng thể

Các vùng hằng định của chuỗi nặng tạo ra chức năng của kháng thể và đại diện cho năm lớp kháng thể khác nhau (Hình 2). Mỗi lớp của chuỗi nặng có trình tự axit amin đặc trưng để phân biệt nó với bốn lớp khác, nhưng cả năm lớp đều có tỷ lệ tương đồng về trình tự axit amin là khá đáng kể. Các lớp gồm IgM, IgD, IgG, IgE và IgA (Bảng 1). Các chuỗi nặng tương ứng với lớp kháng thể khác nhau được ký hiệu bằng chữ cái Hy Lạp: m, d, g, e và a. Ở nhiều loài, có hai hoặc nhiều hơn hai dưới lớp của một số chuỗi nặng chỉ khác nhau ở một số axit amin; con người có 9 chuỗi nặng, mỗi chuỗi có các chức năng sinh học riêng biệt. Có bốn dưới lớp của lớp IgG, được gọi là IgG1, IgG2, IgG3 và IgG4 (Bảng 2). IgA có hai dưới lớp được gọi là IgA1 và IgA2. Chuỗi nhẹ có hai loại, được gọi là kappa (k) và lambda (λ). Sự khác nhau giữa hai loại chuỗi nhẹ là ở trình tự axit amin của vùng hằng định. Tỷ lệ tổng thể của hai loại chuỗi nhẹ trong globulin miễn dịch ở người là khoảng 60% k và 40% l.

Hình 2. Cấu trúc 5 loại kháng thể dịch thể

Cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đều có các vùng chức năng — trình tự axit amin tạo ra tính đều đặn trong cấu trúc bằng các vòng có cầu nối disulfua. Có 2 vùng như thế trên cả k và l của chuỗi nhẹ và 4 hoặc 5 vùng trên chuỗi nặng. Trình tự axit amin trong vùng đầu tiên trên cả chuỗi nhẹ và chuỗi nặng khác nhau rất nhiều giữa các phân tử và được gọi là vùng chuỗi nhẹ thay đổi (VL – variable light domain) hoặc vùng chuồi nặng thay đổi (VH – constant heavy chain). Vùng của chuỗi nhẹ có có trình tự axit amin hằng định cho cả loại k và l, được gọi là vùng chuỗi nhẹ hằng định (CL – constant light domain). Các vùng hằng định của chuỗi nặng được đánh số từ đầu amino tận đến đầu Carbon tận gồm CH1, CH2, CH3 và CH4 (đối với IgM và IgE).

Các gen IgG, IgA và IgD đều có một exon mã hóa cho một khoảng ngắn của các axit amin chiếm không gian giữa các vùng CH1 và CH2. Phân đoạn này giàu cysteine ​​và proline và cho phép tạo ra sự linh hoạt đáng kể giữa hai nhánh của kháng thể; và vùng này được gọi là vùng bản lề và rất dễ bị phân cắt bởi protease.

Động vật có xương sống và không xương sống có một lượng lớn các protein bề mặt tế bào có liên quan chặt chẽ với nhau, nhiều loại trong số đó dường như đã tiến hóa từ các trình tự gen chung.

Gọi chung, chúng được gọi là đại gia đình gen globulin miễn dịch. Tất cả các thành viên của gia đình này đều chứa các vùng Ig có chung trình tự axit amin chính và cấu trúc vật lý gấp nếp beta với các liên kết disulua nội chuỗi. Đại gia đình Ig cũng bao gồm các thụ thể bề mặt và các phân tử kết dính.

2.2. Tương tác kháng nguyên kháng thể

– Gắn kháng nguyên

Cấu trúc phân tử trong vùng biến đổi của một kháng thể – nơi tạo ra tính đặc hiệu kháng nguyên được gọi là idiotype; vị trí tiếp xúc trực tiếp trong vùng biến đổi được gọi là paratop. Mỗi phân tử kháng thể có thể gắn từ 2 đến 10 yếu tố quyết định kháng nguyên (miễn là chúng ở gần nhau về mặt vật lý), tùy thuộc vào số lượng vùng F (ab) có sẵn. IgG, IgD và IgE có hai vị trí gắn F (ab). IgA ở dạng 2 đơn vị có 4 vị trí gắn; IgM gồm 5 đơn vị nên có 10 vị trí gắn. Một kháng nguyên kết hợp với nhiều epitope lặp lại (chẳng hạn như những kháng nguyên được tìm thấy trong vỏ vi khuẩn hoặc nhóm máu ABO carbohydrate) cho phép tăng cường khả năng gắn tổng thể, do đó làm tăng ái lực tổng thể (hoặc ái lực chức năng) của tương tác (Hình 3).

Hình 3. Tương tác đa hóa trị làm tăng ái lực chức năng của liên kết kháng thể-kháng nguyên. Tương tác của các kháng nguyên lặp lại (Ag) với nhiều hơn một vùng gắn kháng nguyên cho phép ổn định hơn và làm tăng ái lực chức năng. Globulin miễn dịch một đơn vị (như IgG) có thể liên kết với một hoặc hai epitop, trong khi đó, globulin miễn dịch 5 đơn vị M (IgM) có thể liên kết tới 10.

– Các lực hóa lý trong tương tác kháng nguyên – kháng thể

Các kháng thể có thể liên kết nhiều loại phân tử với độ đặc hiệu cao, từ các đại phân tử lớn đến các phân tử hóa học nhỏ. Vùng phân tử trên kháng nguyên được các thành phần miễn dịch nhận biết được gọi là epitope, hay yếu tố quyết định kháng nguyên. Liên kết kháng thể với kháng nguyên không liên quan đến liên kết cộng hóa trị. Lực gắn với các epitop trên kháng nguyên, hoặc ái lực tương tác, dựa trên nhiều lực hiện diện trong vị trí gắn (Hình 4).

Hình 4. Các lực không cộng hóa trị góp phần tăng cường tương tác kháng nguyên-kháng thể. Liên kết của kháng nguyên với kháng thể là một tương tác không cộng hóa trị.

– Kháng nguyên và chất sinh miễn dịch

Kháng nguyên (antigen) là bất kỳ chất nào đều có thể được hệ thống miễn dịch nhận ra. Các lớp kháng nguyên chính bao gồm protein, cacbohydrat, lipid và axit nucleic. Ngược lại, chất sinh miễn dịch (immunogen) là bất kỳ chất nào có thể tạo ra phản ứng miễn dịch. Không phải tất cả các kháng nguyên đều có tính sinh miễn dịch. Ví dụ, hapten là các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp tự bản thân nó không sinh miễn dịch nhưng có tính kháng nguyên; hapten trở thành chất sinh miễn dịch sau khi kết hợp với  một chất mang trọng lượng phân tử cao có tính sinh miễn dịch. Quy tắc cần nhớ là tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, nhưng không phải tất cả kháng nguyên đều là chất sinh miễn sinh. Khái niệm này rất quan trọng trong việc sản xuất vaccin.

– Phát hiện các Sequential epitope và Conformational Epitope

Có thể phân biệt 2 lớp chính của epitope. Chúng được mô tả tốt nhất là chúng tồn tại trên kháng nguyên protein, nhưng các loại kháng nguyên khác (ví dụ, carbohydrate và axit nucleic) có thể biểu hiện cả 2  loại epitope này trong một số trường hợp. Sequential epitope là các đoạn axit amin ngắn (dài từ 4 đến 7 inch) có thể được các kháng thể nhận ra khi đoạn peptit ngắn tồn tại tự do trong dung dịch hoặc khi nó được liên kết hóa học với một phân tử protein khác (tức là kháng thể nhận biết các axit amin nằm cạnh nhau trên một chuỗi). Conformational epitope yêu cầu hình dạng cấu trúc ba chiều ban đầu của phân tử phải còn nguyên vẹn, và các yếu tố quyết định kháng nguyên không cần nằm liền kề nhau trên một chuỗi; sự biến tính của phân tử phá hủy các epitope này.

– Phản ứng chéo

Các lực làm trung gian nhận biết kháng nguyên-kháng thể cho phép một mức độ đặc hiệu cao. Nghĩa là, các kháng thể đặc hiệu cho một epitope hoặc hapten có thể dễ dàng phân biệt epitope hoặc hapten đó với các cấu trúc tương tự khác. Tính đặc hiệu này không phải là tuyệt đối; các kháng thể đặc hiệu cho một loại epitope có thể liên kết với các epitope tương tự nhưng không giống hệt về cấu trúc với ái lực thấp hơn. Phản ứng chéo đề cập đến tình huống trong đó một kháng thể có thể phản ứng với hai phân tử tương tự vì chúng có chung một hoặc nhiều epitope giống hệt nhau hoặc epitope đủ giống về trình tự hoặc hình dạng với ái lực yếu hơn. Ví dụ, các kháng thể phản ứng với độc tố giảm độc lực cũng tác động lên các độc tố thật sự của vi khuẩn, cho phép ứng dụng vào sản xuất các loại vaccin bằng kháng nguyên không gây bệnh như vaccin giảm độc lực của độc tố uốn ván và độc tố bạch hầu.

3. TÍNH ĐA DẠNG CỦA KHÁNG THỂ

3.1. Cơ sở di truyền của cấu trúc kháng thể

Khả năng liên kết kháng nguyên của thụ thể tế bào B được tạo ra trước khi tiếp xúc với kháng nguyên thông qua sự sắp xếp lại DNA bằng sự tổ hợp của nhiều gen để đạt được sự đa dạng cao nhất cần thiết cho các đáp ứng miễn dịch. Tái tổ hợp xảy ra đối với cả gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nhờ phức hợp enzym được gọi là V(D)J recombinase. Recombinase là sản phẩm của hai gen (RAG-1 và RAG-2; viết tắt của recombinase-activating genes hay gen hoạt hóa recombinase); khiếm khuyết trong RAG-1 hoặc RAG-2 có thể gây ra một loạt các thiếu hụt miễn dịch nghiêm trọng với các biến chứng lâm sàng nguy hiểm.

Kết cấu của các gen chuỗi nặng gồm 3 vùng khác nhau góp phần tạo ra vùng biến đổi. Các đoạn gen này được gọi là VH (Variable – biến đổi), DH (Diversity – đa dạng) và JH (Junction – nối) (Hình 5). Có khoảng 50 gen VH, 20 gen DH và tối đa 6 gen JH có trong DNA mầm. V(D)J recombinase làm trung gian cho việc nối các đoạn gen khác nhau thông qua cơ chế, trong đó các đoạn xen kẽ được tách ra khỏi bộ gen của tế bào B. Quá trình này đòi hỏi sự kết cặp của trình tự gen gồm 7 cặp bazơ và 9 cặp bazơ, sau đó đoạn DNA xen kẽ được “thắt thành vòng” và bị loại bỏ vĩnh viễn khỏi nhiễm sắc thể. Để hoàn tất quá trình, quá trình ghép nối thay thế sẽ mang trình tự VDJ được sắp xếp lại cùng với các đoạn gen riêng biệt mã hóa cho vùng CH (hằng định).

Các sự kiện tương tự xảy ra trong việc sắp xếp lại các locus của chuỗi nhẹ. Ở người (và hầu hết các loài động vật có vú khác) có 2 chuỗi nhẹ k và λ nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Sự sắp xếp DNA mầm đối với chuỗi nhẹ tương tự như locus chuỗi nặng, ngoại trừ không có đoạn gen D. Ngoài ra, đối với locus k chỉ có 1 vùng hằng định, trong khi locus λ có nhiều vùng hằng định, mỗi vùng có đoạn gen J riêng.

Hình 5. Tổ chức di truyền và các sự kiện tái tổ hợp. Sự đa dạng kháng thể được tạo ra bởi các sự kiện tái tổ hợp DNA trong đó có sự kết hợp ngẫu nhiên các vùng V, D và J. Sự tái tổ hợp được thực hiện theo một trật tự xác định bởi các enzym RAG-1 và RAG-2. Các sự kiện đầu tiên lên đến đỉnh điểm trong việc phiên mã mã hóa mRNA cho immunoglobulin M và D; các quá trình dịch mã khác nhau xác định polypeptit trưởng thành sẽ là một hay cái khác. RAG, recombinant activating genes; L, trình tự dẫn đầu; V, Variable; D, Diversity; J, Junction; C, vùng hằng định

3.2. Tạo ra sự đa dạng của kháng thể

Các phần của vùng biến đổi mà tham gia vào liên kết kháng nguyên được gọi là vùng xác định tính bổ sung (CDR – complementarity-determining regions). Các axit amin trong các vùng siêu biến đổi này tiếp xúc với các gốc để tìm kháng nguyên; các CDR tạo thành vùng bổ sung cấu trúc cho các epitope kháng nguyên, và sự khác biệt về liên kết kháng nguyên là do sự khác biệt trong các trình tự này. Hai trong số các CDR (CDR1 và CDR2) được “nối cứng” vào đoạn gen V và do đó phụ thuộc vào đoạn V được chọn trong quá trình sắp xếp lại. CDR3 bao gồm phần nối của các đoạn gen V, D và J và do đó có mức độ biến đổi cao. Các CDR của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ đều tham gia vào quá trình hình thành túi gắn kháng nguyên (paratope).

Bốn cơ chế chính để tạo ra sự đa dạng kháng thể ở người xảy ra trong quá trình phát triển tế bào B, trước khi tiếp xúc với kháng nguyên. Những cơ chế này làm phát sinh một loạt các kháng thể mà theo lý thuyết có khả năng nhận ra khoảng  epitope khác nhau.

3.3. Nhiều đoạn gen biến đổi

Có hơn 50 đoạn gen V trong locus chuỗi nặng; có khoảng 40 đoạn gen V trong mỗi locus k chuỗi nhẹ và gần số đó trong mỗi locus λ chuỗi nhẹ.

3.4. Tính đa dạng được tổ hợp lại

Các vùng V, D và J trong chuỗi nặng (và các vùng V và J trong chuỗi nhẹ) được chọn ngẫu nhiên trong quá trình sắp xếp lại V(D)J. Do đó, 50 gen VH × 26 gen DH × 6 gen JH tạo ra hơn 6000 tổ hợp locus VDJ chuỗi nặng có thể có. Mức độ biến đổi ít hơn trong tái tổ hợp chuỗi nhẹ vì không có vùng D; có khoảng 200 và khoảng 160 tổ hợp VJ khác nhau lần lượt của k và λ.

3.5. Tổ hợp chuỗi nặng và nhẹ

Bởi vì các locus chuỗi nặng và nhẹ tái tổ hợp độc lập, nên mỗi tế bào B sẽ chứa một tổ hợp khác nhau của các chuỗi nặng và nhẹ được chọn ngẫu nhiên.

3.6 Tính đa dạng của vùng nối và tính đa dạng của vùng được chèn vào

Sự tái tổ hợp giữa các đoạn V và D-J và giữa các phân đoạn D và J không chính xác, và thường làm cho vị trí nối giữa các đoạn bị xáo trộn bởi một vài cặp bazơ. Sự “cẩu thả” này gây ra sự khác biệt trong trình tự axit amin và dẫn đến sự đa dạng của vùng nối. Sự đa dạng của vùng được chèn vào là kết quả của hoạt động của deoxynucleotide transferase đầu tận, một loại enzyme xuất hiện trong quá trình sắp xếp lại chuỗi nặng. Enzyme này bổ sung các nucleotide một cách ngẫu nhiên tại các điểm nối V-D và D-J.

4. CHUYỂN ĐỔI LỚP KHÁNG THỂ VÀ SỰ TRƯỞNG THÀNH CỦA ÁI LỰC

Sự sản xuất kháng thể chỉ xảy ra sau khi kháng nguyên kích thích globulin miễn dịch gắn trên màng tế bào B. Sự biệt hóa thành tế bào plasma (tương bào) thường xảy ra ở các trung tâm mầm của hạch bạch huyết, lách, hoặc mô lympho liên kết với niêm mạc. Quá trình này đòi hỏi cả sự nhận dạng kháng nguyên và sự trợ giúp dưới dạng các cytokine của tế bào T. Trong quá trình biệt hóa, có thể xảy ra 2 quá trình làm thay đổi các đặc tính sinh học của kháng thể được tiết ra. Đầu tiên là chuyển đổi lớp kháng thể (Isotype switching), trong đó xảy ra việc loại bỏ các trình tự DNA xen vào, cho phép các kháng thể chuyển từ IgM và IgD sang lớp kháng thể khác (Hình 6).

Chuyển đổi lớp xảy ra khi các tế bào B đã được kích thích bởi kháng nguyên nhận được tín hiệu cytokine từ các tế bào T helper. Vùng V không thay đổi trong quá trình chuyển đổi lớp; do đó, tính đặc hiệu kháng nguyên giống nhau vẫn được giữ lại. Chuyển đổi lớp liên quan đến việc xóa DNA xen vào giữa các vị trí tái tổ hợp cụ thể được gọi là vùng chuyển đổi. Bởi vì DNA xen vào bị mất, nên tế bào B không thể “chuyển đổi trở lại” thành một lớp kháng thể đã bị xóa. Vùng V và vùng C được phiên mã cùng nhau, quá trình nối và dịch mã của RNA dẫn đến sự biểu hiện của lớp kháng thể mới.

Quá trình thứ hai được gọi là sự trưởng thành ái lực (affinity maturation), trong đó DNA mầm có thể bị đột biến, cho phép mã hóacác  kháng thể có ái lực cao hơn để liên kết với kháng nguyên. Quá trình này là kết quả của quá trình siêu đột biến soma (somatic hypermutation) trong đó vùng V của các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể trải qua tốc độ đột biến cao hơn 10.000 lần so với DNA “thông thường”. Quá trình này chỉ xảy ra sau khi có sự kích thích của kháng nguyên. Một số đột biến này làm tăng ái lực của kháng thể với kháng nguyên, và những tế bào B biểu lộ kháng thể có ái lực cao hơn sẽ được kích thích chọn lọc, làm tăng tỷ lệ kháng thể có ái lực cao trong các đáp ứng thứ cấp.

Hình 6. Chuyển đổi lớp kháng thể. Trong quá trình biệt hóa tương bào, lớp kháng thể có thể bị thay đổi khi vùng biến đổi tương tự được tái tổ hợp với trình tự gen của một vùng hằng định khác. DNA xen vào được cắt bỏ, cho phép tạo mRNA cho các lớp kháng thể khác nhau. Việc chuyển đổi lớp tiếp theo có thể xảy ra đối với bất kỳ trình tự mã hóa nào còn lại; Tuy nhiên, sau khi thực hiện xong, không thể thay đổi trở lại ban đầu. INF, interferon; Ig, globulin miễn dịch; L, trình tự dẫn đầu; V, Variable; D, Diversity; J, Junction; C, vùng hằng định.

5. KẾT LUẬN

Sự đa dạng của khả năng liên kết kháng nguyên là kết quả của sự tái tổ hợp V(D)J trong quá trình phát triển tế bào B và đột biến soma sau khi có kích thích kháng nguyên. Sự đa dạng về chức năng sinh học của các kháng thể là kết quả của quá trình chuyển đổi lớp kháng thể, với các chức năng sinh học duy nhất gắn liền với mỗi lớp kháng thể. Mỗi tế bào B riêng lẻ và tất cả các thế hệ con cháu của nó chỉ chứa một loại chuỗi nặng và một trình tự vùng V của chuỗi nhẹ; do đó tất cả đều có tính đặc hiệu kháng nguyên như nhau.

Tính đa dạng của kháng thể đến từ nhiều nguồn: (1) sự hiện diện của nhiều đoạn gen V; (2) đa dạng tổ hợp, do sự tái tổ hợp ngẫu nhiên của các đoạn V, D và J; (3) tính đa dạng của vùng nối và tính đa dạng của vùng được chèn vào, dẫn đến những thay đổi trong các điểm nối V-D và D-J; (4) cùng tồn tại của các cặp chuỗi nặng và nhẹ khác nhau; và (5) siêu đột biến soma.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

  1. Bruce Alberts, 2002. DNA Replication, Repair, and Recombination, Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science, New York.
  2. Hutchings, C. J. (2020). A review of antibody-based therapeutics targeting G protein-coupled receptors: an update. Expert Opinion on Biological Therapy, 1–11. doi:10.1080/14712598.2020.1745770
  3. Jeffrey K. Actor, 2012. Humoral Immunity: Antibody Recognition of Antigen, Elsevier’s integrated review immunology and microbiology, second edition, Elsevier, Philadelphia.
  4. Jeffrey V. Ravetch, 2019. IgG Fc Receptor Evolutionary considerations, Fc Mediated Activity of Antibodies: Structural and Functional Diversity, Springer, New York.
  5. Tonegawa, S. (1983). Somatic generation of antibody diversity. Nature, 302(5909), 575–581. doi:10.1038/302575a0

Bài viết: BSNT Trịnh Ngọc Phát

Đăng bài: Phòng CTXH

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *